在不附加任何保護（hù）劑下直接凍存細胞時，細胞內和外（wài）環境中的水都會形（xíng）成冰晶，能導致（zhì）細胞內發生機械損傷、電（diàn）解質升高、滲透壓改變、脫水、PH 改變、蛋白變性等，能引起細胞死亡（wáng）。如（rú）向培養液加入保護劑，可使冰點降（jiàng）低。在（zài）緩慢的凍結條（tiáo）件下，能使細胞（bāo）內（nèi）水份在凍結前透出細胞。貯存在﹣130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。

細（xì）胞凍存時脫離生長狀態而將其細胞（bāo）特性（xìng）保（bǎo）存起來，待（dài）複蘇時重新進入生長分裂周期。

實驗開始前，將凍存管、15 毫升離心管、移液（yè）管、移液槍（qiāng）、槍頭等放入無菌超淨工作（zuò）台，以紫外線照射（shè） 30 分鍾。采（cǎi）用通風機通風 3 分鍾。以 75%酒精擦拭操作台和雙手。準備好冰盒（hé）。

將離心機（jī）調節至 800 轉，5 分（fèn）鍾。水浴箱調節至 37 度恒溫。取（qǔ）細胞培養基、DMSO、胰蛋白酶等，放於水浴（yù）箱中預熱。

首先消毒雙手和超淨台。取約 10ml細胞培養基放於 15 毫升離心管中。

配置細胞凍存液：凍存液應該提前配製，置於（yú）室溫備（bèi）用，防止臨時配製（zhì）產生的熱量損傷細胞，按無血清培養基 比 血清 比 DMSO=7:2:1 的比例配置細胞凍存液，其中加大凍存（cún）液中血清的比例對（duì）於保存某（mǒu）些脆（cuì）弱的幹細胞以及一些比較珍貴的細（xì）胞很有好處的。

按比（bǐ）例加好凍存液組分（fèn）後，輕輕吸打混勻，置於室溫下待用。

從細胞培養箱中取出細胞，進行瓶口消毒，棄去細胞原來（lái）的培養（yǎng）基。按每（měi） 25cm²/ml胰（yí）酶/EDTA 消化液比例加入消化液，放（fàng）入（rù）顯微鏡下觀察，待所有細胞變圓後立即拿入超淨台內，加入2ml細胞培養基以立即終止消化。

采用無菌（jun1）槍頭輕輕吹打細胞表麵，注意吹打全部培（péi）養表麵，可以按（àn）照（zhào）先左右吹打，後上下吹打的方（fāng）式，取所有細（xì）胞懸液放入一幹淨（jìng）的（de）15毫升離心管內。

配（pèi）平離心（xīn）：采用天平配平兩端，每分鍾 800 轉（zhuǎn），室溫離（lí）心 5 分鍾。

采用羅氏 CASY-DT 快速細胞計數及活（huó）率分析儀進行細胞計數。加入 10ml CASY-ton至以標記 viable 的管（guǎn）子中，加入 100µl 細胞懸液，顛倒混勻三次，可進行細胞計數。可見每（měi）毫升懸液中有活細胞總（zǒng）數。

取出凍存管，注（zhù）明細胞名稱、代數、日期。

離心後，以無菌吸（xī）管吸棄上清液，不要吸到底部的細胞沉澱。將細胞沉澱與凍存液充分混勻，根據計數結果，將細（xì）胞總數調節至細（xì）胞數量為每毫升有 5×10⁵為宜。

將細胞凍存懸液分裝（zhuāng）入細胞凍存管中，一般一（yī）個兩毫升凍存管裝入 1 至 1.5 毫升細（xì）胞凍存（cún）懸液為宜。

嚴密封口後，進行（háng）程序（xù）性降（jiàng）溫凍存：

首先 ﹣4 ℃ 30 分鍾，20 ℃ 30 分鍾，﹣80 ℃過夜，最後進行液氮保存。